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    临床微生物检验的现状和对策
    双击自动滚屏 发布者:admin        发布时间:2010/2/23        阅读:14553

    临床微生物检验的现状和对策

    山西亚森实业有限公司   郭永红

    临床微生物检验侧重对感染性疾病作出快速准确的诊断,应密切与临床相结合,以控制和消灭感染性疾病,以达到保障和提高人类健康水平的目的。目前我国与国外还存在着很大差距,离临床对我们的要求还很远。本人对此提出一些看法,希望能对临床日常的工作起到一定的帮助作用。

    一、目前现状

    1.新的病原体及其所致的感染性疾病不断出现。临床微生物学受到重大挑战之一是出现了许多新病原体引起的新传染病。人们对新传染病的认识和准备不足,缺乏有效的预防、诊断和治疗措施,人群无免疫力,因此来势凶、传播快、范围广、传播途径多,往往造成巨大的经济损失和社会影响,如O157出血性肠炎、疯牛病、O139霍乱、艾滋病、埃博拉出血热、新型肝炎病毒、埃立克体和肺炎衣原体感染、莱姆病、肠病毒71、手足口病、SARS等等,均在世界不同的地区和范围内造成巨大的损失和影响。

    2.许多传统的老病原体出现了临床新问题,对实验诊断提出了新的要求。近10年来,全球结核病形势急剧恶化,据世界卫生组织估计,全球已有20亿人受到结核菌的感染,现有结核病人约2000万,结核已成为传染病的头号杀手。念珠菌感染逐年增多,念珠菌感染成了人类又一主要杀手,特别是在引起医院感染的病原菌中具有重要地位,外伤、烧伤、营养不良,器官移植,糖尿病,肾功能衰竭,血液病,粒细胞减少,以及长期大量应用抗菌药物治疗的患者更易出现念珠菌感染。念珠菌血症的患者死亡率在25%~57%(平均为38%),因此,念珠菌感染的早期诊断和及时治疗成为一项极为紧迫的任务。性病死灰复燃等等。

    3.新老病原体的耐药性明显增强。不仅带来治疗上的困难,也向实验诊断提出了挑战。我国是世界上滥用抗生素最为严重的国家之一。耐药菌引起的医院感染人数,已占到住院感染患者人数的30%左右。2005516健康报以“全耐药细菌露脸再敲警钟”报道了福建泉洲市第一医院检验科从一男性19岁肾结石术后患者尿液中分离出一株致病菌,经细菌鉴定为短稳杆菌,三次重复其体外药敏,结果均为全部耐药。此前国际上已出现了耐全部常用药物的细菌,称之为“全耐药细菌”。全耐药细菌在我国的出现,这无疑是一个危险的信号。抗菌药物的广泛使用,导致了一系列的副作用,在此前我们关注更多的是抗菌药物滥用会使身体器官受损,而现在另一个更为严峻的问题又在向我们逼近,这就是因滥用抗生素而破坏体内正常菌群,最终使病菌耐药性增强而导致疾病无药可治。当前细菌的耐药性问题主要集中在以下6方面,如耐苯唑西林、并对万古霉素敏感性降低葡萄球菌(MRSA)、耐青霉素和多重耐药的肺炎链球菌(PRP)、耐万古霉素的肠球菌(VRE)、产生超广谱β内酰胺酶(ESBL)的肺炎克雷伯菌和大肠艾希氏菌、持续高产染色体I型酶的阴沟、产气肠杆菌和弗劳地枸椽酸杆菌等细菌以及多重耐药的铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌和不动杆菌。多重耐药菌株的出现可导致抗感染治疗失败、造成患者往院天数延长、医疗费用增加和死亡率的上升,使临床抗感染治疗遇到前所未有的困难。

    二、微生物学检验标本采集、运送、验收和处理注意事项
    1.原则

    (1)标本采集
      1)申请单标记必须清楚(姓名、性别、年龄、病历号、临床诊断、标本来源、采集时间、检查项目、抗生素应用情况等),以便实验室能够合理选择培养环境和培养基;
      2)尽量在抗生素应用前采集标本,以避免漏检和提高阳性检出率;
      3)标本采集应严格执行无菌操作;
      4)咽拭、肛拭、伤口拭子等拭子标本,应插入运送培养基送检;
      5)痰、尿液、伤口拭子等混有正常菌群的标本,不可放入肉汤培养基内送检;

    6)采集标本的容器必须经灭菌处理,但不可用消毒剂。
    (2).标本运送
     1
    )标本采集后应尽快送到微生物实验室;

    2)标本采集后在室温下超过2h未送达实验室,可视为不合格标本。
    3).标本验收
     1
    )实验室只能接受和处理合格标本;
     
    2)实验室对不合格标本退回必须说明原因,并应及时与临床联系。
    4).处理

    根据检验目的结合临床资料选择合适的培养基接种标本;抗菌药物治疗的标本,必要时应加入某些物质以中和药物对细菌的抑制作用。

    2.微生物学检验标本的采集和处理

    (1)尿液标本采集和处理

    中段尿标本:中段尿培养结果往往和临床不符,其原因,一是病人未经消毒,直接留取标本,二是尿液不做细菌计数,而以培养结果为准,因而造成假阳性;三是尿液标本未能及时送到实验室,尿液中营养物质丰富,使得污染菌大量繁殖,造成细菌菌数假性增高,致使得出错误的病原学诊断。
      通常留取晨起第一次尿液(此时尿液在膀胱内储存4小时以上);尿液采集后要及时送检,并保证2小时内接种;不能及时送检和接种时,尿液应置4-8冰箱保存;冷藏标本应于8小时内接种;怀疑沙门氏菌感染时,应于发病2周左右采集尿液,怀疑钩端螺旋体感染时,应于发病后2小时采集尿液,上述时间阳性率高。

    尿液微生物学检验标本采集方法如下:

    1)中段尿采集法:成年男性和女性分别用肥皂水清洗尿道口和外阴部,再用灭菌水冲洗尿道口,然后排尿弃去前段尿液,于带盖的无菌盛器中留取中段尿液510ml
      2)导尿法:用导尿管导取1015ml尿液,置灭菌容器中送检;长期留置导尿管者应更换新导尿管留尿;留置导尿时,用无菌消毒法消毒导尿管外部及导尿管口,用无菌注射器通过导尿管抽取尿液送检(不可采集尿液收集袋中的尿液送检);

      3)集尿法:怀疑结核分枝杆菌感染时,于清洁盛器中留取24小时尿液,取其沉渣1015ml送检;
      4)耻骨上膀胱穿刺法:培养结果与临床病情矛盾时可采用此法,一般较少应用;
      5)肾盂尿采集法:必须由临床医生采集。
      (2)粪便标本采集和处理

    1)采集时间:①腹泻患者于急性期,尽量在用药前采集粪便;②伤寒患者于发病2w以后采集粪便;③怀疑霍乱时立即采集粪便送检。
      2)采集方法:①自然排便:取新鲜粪便的粘液、脓血或絮状物等有意义成分,2-3g1-2ml,盛无菌容器内或置于保存液或增菌液内送检;②直肠拭子:用于难以获得粪便或排便困难的患者和婴幼儿,标本采集后插入灭菌试管内送检。
      3)痰及下呼吸道标本采集和处理

    由于痰标本绝大多数仍以自然咳痰方式采取,因而易受上呼吸道分泌物污染,据报道临床所留痰标本50%为唾液,25%为唾液和痰的混合物,25%为真正的痰标本,因此,确定痰标本的质量非常重要。符合要求的痰标本应在低倍镜视野镜中≤10个鳞状上皮细胞,以及≥25个白细胞。

    1)自然咳痰法:①晨痰为佳;②先冷开水漱口清洁口腔和牙齿;③弯腰90°,用力咳出呼吸道深部的痰;④痰量不得少于1ml;⑤痰咳出困难时可先雾化吸入NaCl溶液(100g/L,加温到45)使痰容易咳出。
      2)小儿取痰法:用弯压舌板向后压舌,将拭子深入咽部,小儿因压舌板刺激引起咳嗽,喷出的肺或气管分泌物粘在拭子上可送检。
      3)支气管镜、支气管穿刺、支气管肺胞灌洗等采集法:此采集方法必须由医生操作。

    4)血液及骨髓培养标本

    1)抗生素治疗前,严格无菌静脉采血810ml(儿童14ml);

    2)无菌注入专用培养瓶(成人、儿童、需氧菌、厌氧菌、L型菌不同培养瓶)中送检;

    3)如已用抗生素不能停用时,可于48h内分别于下次用抗生素之前,采取6份血液标本送检;
        4
    )必要时可需氧菌、厌氧菌(占10%)和L型菌同时培养;
        5
    )疑为心内膜炎时,为提高阳性检出率,可酌情不同部位、不同时间,多次采血或动脉采血进行培养;
        6
    )必要时可取骨髓12ml,无菌注入专用培养瓶中送检
        5
    )脑脊液培养标本
       
    采集时间:怀疑脑膜炎时应立即采集脑脊液,最好在应用抗生素之前采集脑脊液。
       
    采集方法:无菌腰穿采集脑脊液35ml,分装到3个无菌小瓶中(各12ml)。用于细菌和病毒检测时脑脊液量不少于1ml;用于真菌和抗酸杆菌检测脑脊液量不少于2ml

    6)穿刺液培养标本包括胸水、腹水、心包液、关节液、鞘膜液等穿刺液培养标本。

    采集时间:一般在用抗生素等抗菌药物治疗之前,或在停止使用抗菌药物之后2-3d采集标本。
       
    采集方法:①无菌操作穿刺抽取标本或外科手术采集标本;②标本采集量应>1ml(结核分枝杆菌培养时应为15ml);③标本采集后注入无菌小瓶或无菌试管中送检;④可在盛器中先加入灭菌肝素然后再加入穿刺液,以防止穿刺液凝固(0.5ml肝素可抗凝5ml标本。

    7)胃液及胆汁培养标本

    抽取空腹胃液5ml,置无菌管内送检;胆汁培养标本由十二指肠引流法或胆囊穿刺法或手术中留取胆汁,采集胆汁量为5ml,置无菌管内送检;胃液和胆汁采集后必须立即送检。
      
    8)脓汁和病灶分泌物培养标本

    脓及分泌物标本,取材不好往往培养出多种细菌,少则2~3种,多则6~7种,实际这些细菌并非引起感染的真正原因,而多是在创面上生长的杂菌,因此一定要采深部分泌物,必要时采取创面和健康部位过渡地段的少量组织进行培养。

    采集前局部消毒,然后无菌采取脓汁或病灶分泌物或组织。标本采集后立即置无菌管内送检。

    9)眼...咽拭子培养标本用拭子常规采集各种标本。标本采集过程中应注意避免被粘膜上的正常菌群污染,标本采集后连同拭子一起置无菌管内送检。
      
    10)泌尿生殖道培养标本

    1)尿道分泌物:清洗尿道口采取尿道口溢出的脓性等分泌物,或用无菌拭子插入尿道24cm处轻轻转动后取出,置无菌试管中送检。
        2
    )阴道、宫颈分泌物:通过阴道扩张器,用灭菌拭子采取阴道口或宫颈管12cm处分泌物,置无菌试管中送检。
        3
    )宫腔分泌物:在必要时用外套保护膜的灭菌导管抽取。
        4
    )前列腺液:清洗尿道口冲洗膀胱后用前列腺按摩法采取前列腺液送检。
        5
    )精液:受检者应5d未排精,清洗尿道口后手淫或体外排精法,射精于无菌容器内送检。
        6
    )溃疡分泌物:灭菌生理盐水溶液清洗患处,用无菌拭子取其边缘或基底部的分泌物,置无菌试管中送检。
       
    11)烧伤感染培养标本
       
    烧伤12h后用无菌棉拭子无菌操作采集标本;要注意从多个创面取样;烧伤严重感染时易发生败血症,创面取样的同时应该采集血样送做血培养(最好同时做需氧菌培养和厌氧菌培养)。
        12
    )厌氧菌感染培养标本
       
    标本采集①要注意避免标本污染和与空气接触,严格遵守无菌操作;②用注射器抽取胸水、腹水、心包液、关节液、胆汁、脑脊液或无菌手术抽出脓液;③抽出液体标本后,要尽快排除注射器内的空气。
       
    标本运送①标本采集后不得冰箱储存,必须尽快(半小时内)送实验室;②运送方法:a注射器运送(标本抽取后尽快排除空气)或接种到专门的运送培养基中直接运送;b含运送培养基的无氧小瓶运送;c厌氧罐运送(组织块);d 大量液体标本运送时要装满标本瓶并立即驱氧,加盖运送;e一般不采用棉拭子法。
        13
    )真菌感染培养标本
       
    浅部真菌感染标本采集①皮肤:常规消毒皮肤,从皮肤癣菌皮损边缘刮取鳞屑,置无菌平皿内送检;皮肤溃疡则采集病损边缘脓汁或组织;②指(趾)指甲:消毒指(趾)指甲并去掉其表面部分,取可疑病变部分,用刀片修成小薄片56片,置无菌容器内送检;③毛发:采集根部断折处,至少56根送检。
       
    深部真菌感染标本采集①血液:无菌采血810ml,注入未用过抗生素的或可中和抗生素的血培养瓶中,立刻送检;如不能立刻送检时血培养瓶应放室温,但不可超过89h;②脑脊液:采样量不少于35ml,分别注入两支无菌试管中送检(一管做真菌培养和墨汁染色;一管测隐球菌抗原和其他培养);③呼吸道及泌尿生殖道深部真菌感染标本采集同一般细菌培养标本。
    三、标本直接制片染色显微镜下观察

    在临床微生物学检验工作中更重要体现在标本直接制片染色显微镜下观察,对于感染性疾病病原体的诊断有重要的意义。痰标本涂片中的白细胞数和鳞状上皮细胞数决定了这个标本是否做培养。同时,菌体形态及是否在白细胞内等信息为痰标本培养出的微生物是否为致病菌提供了重要线索。各种标本的抗酸染色是分枝杆菌感染诊断的重要经典方法。引起急性腹泻细菌从致病机理上分为两类,产毒素性细菌和组织侵袭性细菌。粪便标本直接染色镜检找到大量多核白细胞,提示组织侵袭性致病菌感染,如果肠道菌群紊乱腹泻革兰染色结果可以提示是酵母菌或者是葡萄球菌引起的,水样粪便标本暗视野观察穿梭运动,如果抑动试验阳性,对于霍乱快速诊断有很重要价值。如果脑脊液标本墨汁涂片见有厚荚膜圆形酵母样菌体,给新型隐球菌脑膜炎提供了快速的诊断方法。阴道分泌物涂片,革兰染色对于阴道炎和细菌性阴道病的诊断及其重要,现已有标准方法通过革兰染色涂片诊断细菌性阴道病。泌尿生殖道标本涂片中见到典型肾形的革兰阴性双球菌分布于白细胞内外,可诊断为淋病。

    标本直接制片染色显微镜下观察对检出病原微生物有很重要的意义,一是可以判断标本是否合格;二是可以对一些特殊标本马上进行电话报告;三是选择合适的培养基进行分离培养或增菌;四是可对分离出的微生物与原始的涂片进行比较。

    四、细菌的分离与接种 

    培养细菌时,根据实际情况须将标本接种于不同培养基上,有些标本还需要先增菌在再接种于不同的培养基上。常用方法为平板划线接种法。通过平板划线后,可使细菌分散生长,形成单个菌落,有利于从含有多种细菌的标本中分离出目的菌。分离培养用的平板培养基应表面干燥,可于临用前置35孵育箱内30分钟,这样表面即干燥有利于分离培养,又使培养基预温,对培养某些较娇弱的细菌有利。常用的平板划线接种法有以下几种。

    1. 分区划线法 此法多用于脓汁、粪便等含菌量较多的标本的分离。其方法是首先将接种环灭菌后,沾取标本均匀涂布于平板培养基边缘一小部分(第一区),将接种环火焰灭菌,待冷却后只通过第一区34次后连续划线(为第二区),依次可共划线35区,每一区细菌数可逐渐减少,直到分离出单个菌落为止。

    2. 连续划线法 该法多用于含菌数量较少的标本。其方法是首先用白金耳将标本均匀涂布于平板培养基边缘一小部分,然后由此开始,在培养基表面自左向右连续划线并逐渐向下移动,直到下边缘。

    划线接种时,尽可能作到直、密、匀,有效地利用培养基表面达到充分分离的目的。如果标本含菌较多,接种在强选择培养基(如SS琼脂)上时或标本含菌较少时,采用分区划线法接种,接种环可一直划完各区皿内,中间不必灭菌。

    五、细菌的培养方法

    根据培养细菌的目的和培养物的特性,培养方法分为一般培养法、二氧化碳培养法和厌氧培养法三种。

    六、临床微生物的分类方法

    1.生理学与生化学分类法

         细菌的形态、染色以及特殊结构是最早的分类依据,方法有传统分类法和数值分类法两种。

    1).传统分类法 19世纪以来,以形态生理特征为依据选择稳定的生物学性状,如形态结构、染色性、培养特性、生化反应、抗原性作为分类依据,然后按主次顺序逐级区分。使用方便,分类亦明确,但有主观性。

    2).数值分类法  20世纪60年代,随计算机的应用而发展的分类方法。它对各种生物学性状按等重要原则进行分类,选用50项以上的生理生化指标进行比较,分析相似度,划分属和种,并确定亲缘关系。

    2.遗传学分类法

    遗传学分类是以细菌的核酸、蛋白质等组成的同源程度分类。该分类法的优点是:①对细菌的有较为一致的概念;②使分类不会出现根本性的变化;③可制定可靠的细菌鉴定方案;④有利于了解进化和亲缘关系。

    1).DNAG+C mol%测定 

         DNA分子两条链上4种碱基的总分子量为100,测定其中G+CAT摩尔百分比,能反映出细菌间DNA分子同源程度,习惯上以G+C作为细菌分类标记。不同菌属间的G+C mol%范围很大,在25—75%之间,但同一种细菌G+C mol%相当稳定,不受菌龄、培养条件和其他外界因素影响,亲缘关系越近的细菌,它们G+C mol%越相近。

    2).核酸同源值测定

    利用DNA分子杂交技术测定DNA分子的相似度。其步骤是先提取DNA,加热变性解链,然后将两种变性的DNA(其中一种为标记DNArRNA)混合液在一定的温度下保温复性,重新得到杂交的双螺旋DNA分子,鉴定其双螺旋结合率。结合率大小反映DNA碱基序列相似程度和菌种间的亲缘关系。同一菌的结合率为100%,80—90%的同源为同种内、同亚种的细菌,60-70%的同源性为同种内不同亚种的细菌,20-60%则认为是同属中的不同菌种。

    3).核蛋白体RNA碱基序列测定

    细菌核蛋白体RNA序列比较保守,变化十分缓慢。分离提取细菌16SrRNA,用T1核酸酶消化,分析寡核苷酸的碱基序列可测出rRNA的相关性。绘制各类群关系和树状谱,从而确定种系的发生关系

    七、临床微生物的分类依据

         1. 形态特征
        
    (1)个体形态 镜检细胞形状、大小、排列,革兰染色反应,运动性,鞭毛位置、数目,芽孢有无、形状和部位,荚膜,细胞内含物;放线菌和真菌的菌丝结构,孢子丝、孢子囊或孢子穗的形状和结构,孢子的形状、大小、颜色及表面特征等。
       
    (2)培养特征
        
    1)在固体培养基平板上的菌落(colony)和斜面上的菌苔(lawn)性状(形状、光泽、透明度、颜色、质地等);
         
    2)在半固体培养基中穿刺接种培养的生长情况;
        
    3)在液体培养基中混浊程度,液面有无菌膜、菌环,管底有无絮状沉淀,培养液颜色 等。
          2.
    生理生化特征
       
    (1)能量代谢 利用光能还是化学能;
       
    (2)对O2的要求 专性好氧、微需氧、兼性厌氧及专性厌氧等;
       
    3 )营养和代谢特性 所需碳源、氮源的种类,有无特殊营养需要,存在的酶的种类等。
          3.
    生态习性
         
    生长温度,酸碱度,嗜盐性,致病性,寄生、共生关系等。
          4.
    血清学反应
         
    用已知菌种、型或菌株制成抗血清,然后根据它们与待鉴定微生物是否发生特异性的血清学反应,来确定未知菌种、型或菌株。
         5 . 
    噬菌反应
        菌体的寄生有专一性,在有敏感菌的平板上产生噬菌斑,斑的形状和大小可作为鉴定的依据;在液体培养中,噬菌体的侵染液由混浊变为澄清。噬菌体寄生的专业性有差别,寄生范围广的谓多价噬菌体,能侵染同一属的多种细菌;单价噬菌体只侵染同一种的细菌;极端专业化的噬菌体甚至只对同一种菌的某一菌株有侵染力,故可寻找适当专化的噬菌体作为鉴定各种细菌的生物试剂。

    六、微生物鉴定

    通过分离培养获得的病原菌,必须达到不含有其他微生物的纯培养,才能进行系统鉴定。系统鉴定就是通过病原菌的形态结构、生长特性、抗原性和病原性等检测,并用已知标准免疫血清确定分离细菌的属、种和型。微生物鉴定的程序通常是根据其形态,生长、生化特性等定种,最后根据抗原的免疫血清学检查定型。

    1.形态学检查 各种细菌的形态,在适宜的环境下是相对稳定的。但环境的改变,如培养基条件的改变,抗生素和化学药品的作用等,均可使细菌产生不规则的形态,并可出现细胞壁的缺陷和多样性。为此,在作细菌形态鉴定时,必须按被检菌的生长要求,选择适宜的培养基和培养条件,以及适宜的培养时间和检查方法,才能作出正确的形态学鉴定。形态学检查一般包括二方面:肉眼观察和显微镜检查。

    1.肉眼观察 肉眼观察主要观察细菌在固体、液体、半固体,鉴别培养基上的生长情况。在固体培养基上要观察菌落形态、大小、颜色是否均匀一致,表面是光滑湿润,还是干燥无光或呈皱纹状,边缘是整齐还是不规则,菌落是隆起、扁平,还是乳头样,是透明、半透明或不透明。在液体培养基中,要观察培养基是否呈均匀浑浊,管底有无沉淀,液面有无菌膜,是否产气等。在半固体培养基上应观察细菌是否沿着接种线生长,是呈毛刷样生长还是均匀生长,上下生长是否一致。在鉴别培养基上,应观察其生长情况是否与预期的相一致,在血琼脂培养基上还要观察是否溶血及溶血环的特点,在某些培养基上还要注意是否有臭味等。

    2. 显微镜观察 在作细菌形态学检查时,要根据被检菌的种类和检查项目,选用相应的染色方法,同时要注意选择适合的培养基以及细菌培养的时间,才能达到预期的目的。一般以1824小时(生长时间长的细菌除外)的幼嫩培养菌为宜。例如,作革兰染色检查时,培养时间长的陈旧细菌,可能由阳性变为阴性。作细菌运动性检查时,液体培养基的幼嫩培养物(几小时到十几小时)最为适宜。作炭疽荚膜染色时,因炭疽杆菌在一般培养基上不形成荚膜,而在动物体内形成明显的荚膜,因此,应先接种小鼠,取死亡动物的病料作涂片标本镜检。作鞭毛染色时,以液体培养基为宜。芽胞的形成,因细菌种类不同,往往对培养条件如培养基、空气和培养时间等而异,但一般均要求较长时间。镜检时除注意其基本形态结构和大小(要用测微计测量)外,还应注意其排列状态、菌端形状、有无两极染色、有无形成芽胞和荚胞等。必要时可用电镜观察其微细结构。

    革兰染色性是细菌鉴定的前提,革兰染色错误肯定对细菌鉴定有影响。即使使用自动化仪器也是如此。同时菌体形态、染色性的观察可以修正仪器出现的错误报告。如形态观察很容易区别细菌和酵母样菌,完全可以避免误报;莫拉菌属、不动杆菌属的形态可区分其他常见非发酵的杆菌。革兰阳性菌或阴性菌、阳性球菌和杆菌,阴性球菌或杆菌决定了对细菌采用何种鉴定系统。传统方法中对染色性不定的细菌,还可通过进行万古霉素纸片法敏感试验和3%KOH拉丝试验,起到佐证作用。革兰阳性菌通常对万古霉素敏感、拉丝试验阴性;革兰阴性菌则相反。

    3. 细菌血清型鉴定及血清学试验

    细菌抗原结构比较复杂,有存在于细胞壁的菌体抗原(O抗原)。有运动性的细菌在菌体抗原之外还有鞭毛抗原(H抗原),它具有不同的种、型特异性。包围于细胞壁外面的抗原称表面抗原,它包括种、型特异性很强的荚膜抗原(如炭疽杆菌)以及Vi抗原(沙门氏菌)和K抗原(大肠杆菌)。此外还有存在于某些革兰氏阴性杆菌表面的菌毛抗原。从抗原的特异性程度可区分为:存在于属间细菌所共有的共同抗原,这种抗原的存在,只能表明其属性。另一类抗原为特异性抗原,只存在于特定的种、型,是最后确定细菌种、型的重要依据。

    血清型鉴定是微生物鉴定的特异方法。首先要求鉴定的细菌必须纯净,不能混有其它种细菌,而且要新鲜,细菌要在适宜的条件下培养,尽量减少传代,以防发生变异。其次是要有特异性强和效价高的已知标准免疫血清(包括单克隆抗体)和标准菌株。有些种类细菌,如大肠杆菌和沙门氏菌不仅种、型繁多,而且抗原构造复杂,应购置专门的分型血清以备应用。最后是根据其菌体构造和抗原成份以及实验室的设备技术条件,选择相应的一种或几种血清学试验方法进行鉴定。

        4.数码鉴定法基本原理

    数码鉴定是指通过数学的编码技术将细菌的生化反应模式转换成数学模式,给每种细菌的反应模式赋予一组数码,建立数据库或编成检索本。通过对未知菌进行有关生化试验并将生化反应结果转换成数字(编码),查阅检索本或数据库,得到细菌名称。其基本原理是计算并比较数据库内每个细菌条目对系统中每个生化反应出现的频率总和。

    自动化的微生物鉴定分析系统在临床微生物实验室的应用,为微生物检验工作者对病原菌的快速诊断提供了有力工具。鉴定系统的工作原理因不同的仪器和系统而异。不同的细菌对底物的反应不同是生化反应鉴定细菌的基础,而试验结果的准确度取决于鉴定系统配套培养基的制备方法、培养物浓度、孵育条件和结果判定等。大多鉴定系统采用细菌分解底物后反应液中pH的变化,色原性或荧光原性底物的酶解,测定挥发或不挥发酸,或识别是否生长等方法来分析鉴定细菌。

    使用自动化鉴定仪的局限性

    1.自动化鉴定系统是根据数据库中所提供的背景资料鉴定细菌,数据库资料的不完整将直接影响鉴定的准确性。目前为止,尚无一个鉴定系统能包括所有的细菌鉴定资料。对细菌的分类是根据传统的分类方法,因此鉴定也以传统的手工鉴定方法为金标准。使用自动化鉴定仪的实验室,应对技术人员进行手工鉴定基础与操作技能培训。

    2.细菌的分类系统随着人们对细菌本质认识的加深而不断演变,使用自动化鉴定仪的实验室应经常与生产厂家联系,及时更新数据库。实验室技术人员应了解细菌分类的最新变化,便于在系统更新之前即可进行手工修改。

    3.通过自动化鉴定仪得出的结果,必须与其它已获得的生物性状(如标本来源、菌落特征及其它的生理生化特征)进行核对,以避免错误的鉴定。

     七、药敏试验和方法标准化

    准确的药敏试验首先要有标准的药敏检测试剂,包括药敏纸片和培养基等,其次要求药敏试验方法的标准化。对此,我国SAST和美国NCCLS对药敏纸片的各种抗生素含量和使用的培养基等都有严格的规定,要求临床微生物实验室必须遵循基本法则。NCCLS标准要求药敏试验必须使用有国内国家食品药品监督管理局(SFDA)或美国食品药品管理局(FDA)批准的药敏试剂。然而,目前国内一些临床微生物室并没有严格按规定选用药敏试纸和标准试验方法,致使药敏结果背离临床实际情况,应予矫正。

    1、纸片琼脂扩散法:纸片扩散法(K-B)选用琼脂培养基(MHA),适合快速生长的致病菌;对于苛养菌则需使用嗜血杆菌专用琼脂平皿(HTMA/GCA)KB法简便、经济,但应注意不是所有细菌都适合用该方法检测耐药性。发酵菌K-B法药敏试验只适用绿脓假单胞菌和不动杆菌属的判断标准,其他非发酵菌,如嗜麦芽窄食单胞菌等建议用最低抑菌浓度(MIC)法检测耐药性,以避免误导临床错用抗生素。此外,如果考虑为多重耐药致病菌,还需要进一步确定各种药物的MIC,采用MIC监测,以保证临床用药的有效性。

    2、液体稀释法:用于测定MIC、最小杀菌浓度(MBC)MIC50(能抑制50%试验菌的MIC)MIC90(能抑制90%试验菌的MIC)。液体稀释法比较繁琐,一般不作为常规试验。通常用于调查罕见耐药,调查药敏定性试验结果敏感,但临床疗效不佳的原因,确定中介度的敏感性,有效地选择二线药,评价新药。MIC药敏测定必须关注的是在培养基制备和测定过程中药物的失活,在不同培养基中,因为成分和制备过程中药物变化程度不同出现不同的MIC

    3、浓度梯度法:是一种新型的检测细菌或真菌对抗菌药物敏感性的方法,主要包括一个含有连续抗菌剂梯度的试条。该法与微量稀释法具有良好的一致性,只是浓度梯度(Etest法所测MIC值普遍略高于微量稀释法,可能与Etest法所采用的连续抗菌剂梯度,以及椭圆抑菌环内有微小菌落存在,导致终点判读误差所致。Etest法药敏试验对于探讨耐药机制,准确鉴定耐药性,指导临床合理使用抗生素治疗,对大量使用抗生素的医院选药监测和对新抗生素的评价具有重要意义。

    4、联合药敏试验:对临床上病原菌不明的感染、单一药物不能控制的混合感染、全身性绿脓假单胞菌感染、长期用药可能产生耐药的感染(结核、慢性骨髓炎)和病原菌为多重耐药菌株等,宜作联合药敏试验。

    5、药敏试验的药物选择:为了使药敏试验结果符合临床实际需要,在我国SAST和美国NCCLS标准中,根据临床分离的病原菌类型,对药敏试验的药物选择做了具体规定,并按最新资料每年修正公布。药敏试验中药物选择原则应根据不同菌种选择相应的抗菌药做药敏,而且抗菌药物的选择必须合理,并经济实用。

    药敏试验分析系统的基本原理是将抗生素微量稀释在条孔或条板中,加入菌悬液孵育后放入仪器或在仪器中直接孵育,通过测定细菌生长的浊度,或测定培养基中荧光指示剂的强度或荧光原性物质的水解,观察细菌的生长情况。在含有抗生素的培养基中,浊度的增加提示细菌生长,根据判断标准解释敏感或耐药。

    当然,微生物鉴定和药敏试验不能完全依赖仪器,仪器使用者需要有较多丰富的传统微生物鉴定方面的经验,仪器与手工相结合,MICK-B相结合,取长补短,才能逐渐将微生物工作做得更好!

    下列抗生素/微生物组合在体外可出现活性,但在临床上无效,不应报告敏感

    微生物

    不作为敏感报告的抗微生物药

    ESBL 肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯

    菌、大肠埃希菌和奇异变形杆菌

    青霉素类,头孢菌素类和氨曲南

    沙门菌属、志贺菌属

    Ⅰ、Ⅱ代头孢菌素和氨基糖苷类

    苯唑西林耐药葡萄球菌属

    所有青霉素类,头孢类和其它β-内酰胺类,

    如阿莫西林/克拉维酸、哌拉西林/他唑巴坦和

    亚胺培南

    肠球菌属

    氨基糖苷类(除外高浓度)、头孢菌素类、克林

    霉素和甲氧苄啶/磺胺甲噁唑

    八、微生物实验室在医院感染监测中的作用

    伴随着现代诊疗技术的发展,控制医院感染已成为当前医学发展中的重要环节。卫生部将监测和控制医院感染的优劣列为综合医院分级管理标准的重要指标之一。临床微生物检验人员作为医院感染检测和控制中一支生力军,其作用尚未得到充分发挥,因此,加强与发挥临床微生物实验室的监控作用是控制医院内感染的重要因素。

    医院感染的监测包括:病人的准确统计、病原体和耐药性的精确分析、消毒灭菌的质量控制、危险因素的相关分析,相关病区重点监测,医院感染爆发流行的及时发现和控制以及病人、医护人员和环境的消毒隔离。

    九、目前迫切需要解决的问题

    1.感染微生态学的新认识

    传统的生物病因认为感染是由致病性微生物引起的。微生态学却认为,感染是生态平衡与生态失调相互转化的重要内容。引起感染的微生物不一定是致病菌或病原体,而是正常微生物群易位或易主的结果。其中的肠道正常菌群易位引起感染已引起了广泛的关注。肠道易位的细菌主要为兼性厌氧菌,其中革兰染色阴性杆菌占了很大一部分。通常易位的细菌与其在肠道中的数量密切相关,细菌数量越多,发生易位的可能性越大,但在正常人群,肠道内数量上占优势的专性厌氧菌如双歧杆菌并不发生易位。肠道细菌易位的主要原因有肠道内菌群失调,肠粘膜屏障通透性增加和宿主免疫功能下降,比如出血性休克、烧伤、外伤、肠道缺血、急性胰腺炎、严重感染、急性肝衰竭以及肝硬化等均可导致细菌易位。各种原因尤其在抗生素治疗期间引起的肠道菌群失调,均可导致细菌易位扩散,如灭滴灵可显著增加肠道大肠埃希菌(E coli)易位到局部淋巴结的发生率,引起肠道外的感染(脓毒血症、肺部感染、腹腔感染等);动物实验发现在肠道缺血再灌注时经常发生细菌易位,发生肠道易位的细菌数量依次为大肠埃希菌、变形杆菌、凝固酶阴性葡萄球菌和肠球菌。

    临床研究发现,许多患者虽有菌血症、脓毒血症、全身炎症反应综合征或多器官功能不全综合征(MODS)等,但没有明确的感染灶。我们推测,肠道细菌和各种毒素易位可能参与其感染的形成和发展。

    2.厌氧菌培养

    由于诸多因素造成开展厌氧菌检验不广泛、不深入。实际上临床厌氧菌感染范围广、感染率高,近年资料表明,肌坏死,腹膜炎等厌氧菌感染率分别高达100%94%,如果不开展厌氧菌培养,就漏掉了感染的病原菌、延误治疗。

    3.帮助临床合理应用抗生素

    对于耐药菌感染,现在并没有太多有效的治疗药物,治疗的效果也不理想。例如,重症监护和器官移植的患者中,有半数多死于耐药菌感染而非原发疾病。临床现在大多采用广谱抗生素或多种药物联合来治疗耐药菌感染。但这可能导致更加广泛耐药的细菌产生。现在,由于缺乏有效的抗生素,不得不重新启用一些因毒性太强已经被淘汰的抗生素,例如多粘菌素。
       
    抗生素的资源是有限的,滥用抗生素的趋势如果继续,很快就会面临无药可用的窘境。将回到十九世纪青霉素没有被发现之前的时代。抗生素与耐药菌,在自然界中就存在,并一直处于动态平衡之中。大量滥用抗生素,导致这样的平衡被打破,细菌耐药性也越来越强。合理使用抗生素可以大大延缓耐药的发生。即使在细菌耐药情况已经很严重的地区,合理使用抗生素之后,也可以缓解耐药的情况。

    过去细菌学检验工作只注重准确的细菌学报告,不太关心临床实际的治疗效果,注重准确的细菌学结果固然重要,但这不应是我们工作的全部,检测病原微生物对抗生素的敏感性是临床微生物实验室最重要的任务之一。抗生素敏感性检测的主要目的是预测抗生素的治疗效果,并帮助临床医生针对某一特定的临床感染问题选择最合适的药物。

    近年来卫生部相继颁布了三个文件:《医疗机构药事管理暂行规定》,《处方管理办法(试行)》和《抗菌药物临床应用指导原则》。要很好地执行这些文件,根据细菌培养和药敏试验结果正确选用抗生素是一个重要方面,以有效控制感染。如今抗生素已列入处方药,医生的责任和任务更加重大,全耐药细菌的出现,再次敲响了抗生素耐药的警钟,这个警钟不仅敲给患者,更重要的是敲给医生听的,如果还是算计着什么赚钱就开什么药,那就不只是在谋财,更是在害命了。

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